AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificación.

 

A)    MÉTODOS DE ESTIMACIÓN - UNIDADES

El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad mediante el cual pueda valorársela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificación tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y después de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Sólo en términos cuantitativos se puede saber si se ha producido algún progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima está dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que ésta sea una operación rápida; es preferible sacrificar precisión por rapidez en las determinaciones.

 

La naturaleza del ensayo dependerá del tipo de reacción que cataliza la enzima. A veces resultará conveniente la medición de la aparición de un producto y otras la medición de la desaparición de sustrato.

 

La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH, concentración; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades. La elección del sustrato es muy importante: debe ser barato, de fácil determinación, estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentración tal que sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la concentración de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima.

 

En general, en los tejidos, una enzima puede estar presente en una proporción de 1/10 a 1/100 del material total. Es necesario definir una unidad enzimática arbitraria para poder expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificación. La unidad enzimática se define en forma particular para cada reacción según sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formación de una determinada cantidad de producto (desaparición de reactivo) en un tiempo dado.

 

La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica que es el cociente de actividad enzimática (expresada en unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas.

 

B)   FUENTE DE LA ENZIMA

La actividad de una enzima varía considerablemente en diferente organismos y aún en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecanísticos generales, debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la mayoría de las enzimas se deterioran rápidamente. Frecuentemente una buena elección de la fuente de enzima permite simplificar la extracción y purificación de la enzima.

 

C)   IMPORTANCIA DE LA LOCALIZACION INTRACELULAR DE LA ENZIMA

Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos:

I.  Enzimas en solución verdadera en el citoplasma. Permanecen en el sobrenadante luego de la eliminación de los componentes particulados. La ruptura de las células en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio.

II. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden encontrarse a) en “solución” dentro de una memrana y pueden ser extraídas después de la destrucción de la misma; b) asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solución debe disociarse el complejo.

 

El conocimiento de la localización intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido desarrollar procedimientos de extracción diferencial que facilitan la purificación.

 

D)  EXTRACCION DE ENZIMAS

Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solución son a menudo críticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las células, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras moléculas. A veces es necesario pasarlas a solución como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificación.

Aunque la dispersión de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecánicos, en muchos complejos enzimáticos están involucradas fuerzas específicas; de la naturaleza de las mismas depende el método a emplear.

En general, el primer paso consiste en la obtención de un homogenato, que implica la destrucción de la célula y el pasaje de las enzimas a solución o suspensión. Esto puede llevarse a cabo por:

 

a)   Homogenización mecánica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como alúmina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotónico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertónico, en un buffer adecuado para controlar el pH.

 

b)  Homogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, riñón, eritrocitos).

 

c)  Desintegración t­érmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido.

 

d)  Desintegración química: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, éter de petróleo, isopentanol, etc.

 

e)   Homogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de proteínas por solventes orgánicos. En la preparación del "polvo acetónico" se utiliza acetona en frío.

E)   PURIFICACION

Los métodos a elegir dependen de la fuente biológica y de la concentración de la enzima, y se basan en las distintas propiedades fisicoquímicas de las proteínas.

El primer paso consiste en la separación de los distintos componentes intracelulares, generalmente por centrifugación. Las partículas que difieren en densidad o tamaño sedimentan a distintas velocidades por aplicación de una fuerza centrífuga (campo gravitacional, g). Una centrifugación diferencial permite la separación del homogenato en varias fracciones. Un esquema tipo es el siguiente:

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Cada una de las fracciones precipitadas puede tratarse con agentes químicos para solubilizar las enzimas que fuesen particuladas. A partir de aquí comienza la purificación.

 

Los procesos de purificación utilizan las técnicas clásicas de fraccionamiento proteico y pueden basarse en el movimiento de sustancias en una fase líquida (electroforesis o filtración en geles) o en la transición de sustancias de una fase a otra (cromatografía o precipitación). La elección de un determinado procedimiento es un problema de prueba y error: hay que probar procedimientos y seleccionar. En general, la repetición de un paso es ventajoso, ya sea en forma sucesiva o interpolando otros pasos, aunque a veces provoca grandes pérdidas de actividad total. Una vez llevado a cabo un paso satisfactorio, la cantidad de material resultante debe ser manejable antes de pasar al paso posterior.

 

Aparentemente los métodos pueden usarse en cualquier orden y el mejor orden se determina experimentalmente. Existen sin embargo ciertas restricciones que hacen que haya un orden lógico.

 

Por ejemplo, el calentamiento tiene por objeto eliminar grandes cantidades de proteínas inespecíficas y no requiere el agregado de grandes volúmenes de líquido; es lógico, por lo tanto, que se haga al principio. En muchos casos no es practicable por la inestabilidad de la enzima o por la presencia de enzimas proteolíticas que la dañarían mucho al elevar la temperatura, o bien porque no aumenta el grado de purificación.

 

 F)  ANÁLISIS DE LOS DATOS

Para juzgar si un método de purificación es adecuado, deben calcularse la recuperación y el grado de purificación alcanzados.

Considerando las unidades enzimáticas totales de la etapa inicial como el 100% puede calcularse el rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades totales de cada paso a las iniciales. Para calcular el grado de purificación, debe obtenerse primero el valor de actividad específica alcanzado en cada paso. Si se considera la actividad específica inicial como unidad de purificación, el grado de purificación de cada etapa se calcula haciendo el cociente entre la actividad específica de dicha etapa y la del primer paso.

 

GCRITERIOS DE HOMOGENEIDAD

Cuando una purificación enzimática ha alcanzado la etapa donde posteriores purificaciones o pasos no producen un incremento en la actividad específica, pueden investigarse con métodos analíticos la homogeneidad y pureza de la preparación obtenida. Pueden utilizarse métodos cromatográficos, electroforesis, ultracentrifugación, focalización isoeléctrica. La obtención de un único pico proteico es indicativo de homogeneidad, si esto ha sido comprobado por varios métodos.