Prácticas  de LABORATORIO

 

OBJETIVOS GENERALES

Que el alumno conozca:

·        Las principales propiedades de las proteínas y que se familiarice con los procesos generales de extracción, identificación y cuantificación de las mismas.

·        Que las enzimas constituyen una clase especial de proteínas, que requieren condiciones óptimas de acción, que catalizan reacciones químicas específicas y que para su funcionamiento resulta esencial mantener la conformación nativa.

I. PROTEÍNAS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

·        Discutir la importancia de la elección del método de obtención de una muestra.

·        Comprender los fundamentos de las técnicas que permiten detectar la presencia o ausencia de proteínas en muestras biológicas.

·        Discutir el significado de los términos falso positivo y falso negativo aplicados a una reacción de caracterización.

·        Conocer el significado y la importancia de la expresión sensibilidad del método y discutir las condiciones en que determinado método se puede aplicar.

·        Realizar ensayos de caracterización cualitativos de proteínas en diferentes muestras biológicas.

·        Realizar la determinación de la cantidad de proteínas presentes en una muestra por métodos colorimétricos: ensayo de caracterización cuantitativo.

·        Construir una curva de calibración para proteínas.

1. Extracción y valoración de las proteínas presentes en frutos

Para obtener un determinado componente a partir de un material biológico deben realizarse distintas operaciones, tales como extracción, aislamiento y purificación. La necesidad de efectuar una o más de estas operaciones dependerá del material de partida y de los objetivos perseguidos. Por ejemplo, si se desea determinar el contenido de glucosa en orina, no es necesario realizar ninguna operación previa (salvo las indicadas por el método elegido), ya que este monosacárido se encuentra disuelto en la orina. En cambio, si se desea determinar la concentración de glucógeno en células hepáticas de cobayo, necesariamente se deberá:

a)    separar  y disgregar el tejido hepático del animal y

b)    “liberar” el glucógeno de las células, esto es, realizar las operaciones necesarias para extraer el glucógeno hepático.

Asimismo, dependiendo del método de determinación a emplear, será necesario realizar una o varias etapas de separación o aislamiento del glucógeno: separarlo de otros componentes celulares que puedan interferir con las determinaciones. Por último, si el objetivo es analizar la estructura del glucógeno, será necesario purificarlo.

        En el presente trabajo práctico se realizará una extracción de las proteínas solubles en medio acuoso que se encuentran presentes en frutos. Luego de la extracción, las proteínas serán separadas de impurezas tales como azúcares y pigmentos por tratamiento con acetona, que produce la precipitación de las proteínas, las que luego serán redisueltas y posteriormente cuantificadas por el método de Bradford.

2. Reacción del biuret

Fundamento de la reacción

Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y los pares electrónicos libres de los nitrógenos de los grupos imino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.

        Retomando lo visto anteriormente en el trabajo experimental del módulo 2 (ver “algunas consideraciones”), cuando se caracteriza un grupo o familia de sustancias (por ejemplo, caracterización cuali o cuantitativa de proteínas en una muestra problema) o identifica una sustancia en particular (por ejemplo comprobar la presencia de ovoalbúmina en clara de huevo) se debe tener muy en cuenta el objetivo que se persigue. En función de este objetivo se seleccionará el método más indicado.

        La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos.

        Un resultado negativo de la reacción del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir a) que no existan proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas), b) que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composición aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de péptidos generados por una reacción de hidrólisis ácida, los H+ del medio interferirán con la reacción del biuret, ya que ésta necesita de un medio alcalino para la formación del complejo con Cu++. En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendría un falso negativo como resultado) y c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor. Existen métodos mucho mas sensibles que el biuret (ver mas abajo).

 

3. Reacción de Bradford

Fundamento de la reacción

El método involucra la unión de un colorante, el Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) a las proteínas. La solución del colorante libre es de color rojizo (máxima absorción a 465 nm) y cambia al azul (máxima absorción a 595 nm). La unión es un proceso rápido (aproximadamente 2 minutos) y el complejo colorante-proteína se mantiene estable hasta una hora después de producido.

Como en esta reacción el CBB se une específicamente a las proteínas, es un buen método de caracterización (aunque no de identificación). La reacción se prefiere a otras por su sensibilidad (mayor que la del biuret), lo que significa que, para una misma muestra, puede obtenerse un resultado positivo con el reactivo de Bradford pero negativo con el reactivo del biuret.

Dado que aún los materiales biológicos más sencillos poseen una composición química compleja, siempre se debe de tener en cuenta la posibilidad de interferencias (positivas o negativas). Tambien se debe tener en cuenta que no siempre son las mismas sustancias las que interfieren en los distintos métodos. En el caso de extractos vegetales es común encontrar sustancias como los fenoles que por lo general producen interferencias en muchos de los métodos de caracterización de proteínas. La reacción de Bradford es de elección en estos casos pues los mencionados compuestos no producen interferencia.

Confección de la curva de calibración

Una vez que se ha detectado la presencia de un componente es importante conocer la cantidad del mismo presente en la muestra y en consecuencia se debe hallar una manera de cuantificarlos. Para llevar a cabo el análisis cuantitativo es necesario efectuar una curva de calibración. Para la confección de dicha curva se utilizan diluciones de una proteína pura de concentración conocida (proteína patrón; en nuestro caso utilizaremos albúmina bovina). Sobre cada dilución se lleva a cabo la reacción de Bradford y la curva de calibración se obtiene graficando los datos de absorbancia [2] correspondientes a cada una de las diluciones versus la concentración de proteína de las mismas. El rango de detección de proteínas para el método es de 0,1 a 1 mg/ml, dentro del cual la relación absorbancia-concentración se mantiene lineal.

4. Ensayos de estabilidad de proteínas en dispersión acuosa

Las proteínas se mantienen dispersas gracias a interacciones con las moléculas de solvente y de solutos presentes. Su estabilidad, al igual que sucede con otras macromoléculas que forman dispersiones coloidales, se fundamenta en dos factores: hidratación y carga eléctrica, que actúan contraponiéndose a la influencia de la gravedad que tiende a producir la sedimentación de las partículas dispersas. En el seminario de trabajos prácticos se discutirá en detalle de qué forma distintos agentes (pH, agentes deshidratantes, solventes orgánicos, etc) influyen sobre la estabilidad de las proteínas.

5. Electroforesis

Fundamento

Si se aplica un campo eléctrico a una solución que contiene una molécula con carga neta (+ o -), ésta migrará a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamaño y su forma. Esta técnica, denominada electroforesis, se utiliza para separar mezclas de moléculas cargadas (proteínas, ácidos nucleicos), ya sea sobre un soporte (papel, cellogel) o dentro de un gel (agarosa, almidón o poliacrilamida).

La movilidad electroforética es la relación de la velocidad de la molécula (v) y el potencial eléctrico (E). También es igual a la carga neta de la molécula (Z) dividida por el coeficiente friccional (f), que es la resistencia que el gel opone al movimiento de la partícula.

En la fórmula puede verse que a mayor carga eléctrica, mayor será la movilidad de la molécula.

Un parámetro importante a considerar en la electroforesis de aminoácidos y proteínas es su punto isoleléctrico (pI), ya que conociendo el pI y el pH del medio, conoceremos la carga de la molécula. Cuando el pH es mayor que el pI la molécula tendrá carga negativa; por el contrario, si el pH es menor que el pI la carga de la molécula será positiva. De esta manera, de acuerdo al pH del buffer de electroforesis utilizado, la muestra se sembrará en uno u otro polo: si la molécula tiene carga negativa se sembrará cerca del polo negativo (cátodo), con lo que migrará hacia el polo positivo (ánodo) y viceversa.

II. ENZIMAS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

·        Detectar la presencia o ausencia de actividad enzimática en saliva (actividad amilolítica) y en jugo de ananá (actividad proteolítica).

·        Determinar el valor de la actividad enzimática variando algunos parámetros que la afectan (pH, temperatura).

Si en un extracto biológico se desea establecer la presencia de una determinada proteína con actividad biológica, tal como una enzima, no basta con determinar la existencia de dicha proteína, sino que se requiere un ensayo que pruebe que la misma es biológicamente funcional. Cuando la actividad biológica es específica (como ocurre en el caso de las enzimas) resulta innecesaria la etapa de purificación, ya que la actividad biológica será evidenciable aún en presencia de otras proteínas, aunque será necesaria la eliminación de cualquier sustancia que interfiera con su actividad.

Para medir la actividad enzimática sólo se requiere un método analítico sencillo que determine la desaparición del sustrato o la aparición de los productos de reacción.

 

S
 

Enzima
 

P
 

Sustrato
 
Productos


Para medir la influencia del pH, de la temperatura, de la concentración de enzima, etc. sobre la velocidad de la reacción, debe realizarse dicha reacción variando el factor en estudio y dejando constantes todos los demás.

1. Degradación de almidón por acción de amilasa salival

Fundamento

El método se basa en la hidrólisis del almidón (sustrato), en condiciones de pH y temperatura fisiológicos, por acción de una amilasa presente en la saliva. Los productos de reacción son polisacáridos de menor peso molecular hasta llegar a disacáridos (maltosa), no evidenciables con el reactivo de Lugol (pero sí con Fehling).

2. Determinación de la actividad proteolítica de las enzimas presentes en el jugo de ananá

Fundamento:

El método se basa en la hidrólisis de la caseína (sustrato) por acción de enzimas proteolíticas (proteasas) en condiciones de pH y temperatura adecuados, obteniéndose como producto de reacción péptidos de menor peso molecular, que no precipitan por el agregado de ácido tricloroacético y que pueden evidenciarse por medio de la reacción del biuret.

Medida de la actividad proteolítica


 

 

 
proteasas
 
CASEÍNA
péptidos pequeños

 

La reacción se detiene por inactivación de la enzima proteolítica con ácido tricloroacético al 5% (TCA 5%). Es necesario realizar blancos de reacción (tiempo cero de la reacción) y para ello la enzima es inactivada con TCA 5% antes de la adición del sustrato.

La concentración de péptidos solubles en TCA formados luego de la reacción enzimática es directamente proporcional a la cantidad de caseína hidrolizada y por lo tanto es un medida directa de los productos de la reacción proteolítica. Estos péptidos serán cuantificados por la reacción del biuret. Si deseamos conocer el tipo y número de péptidos formados se debe realizar un análisis por electroforesis.

Al detener la reacción con TCA (más aun si se defectúa a tiempos cortos) observaremos la presencia de un precipitado que corresponde a la caseína que no ha sido hidrolizada por la enzima. Este precipitado puede redisolverse con hidróxido de sodio al 10% y determinarse la concentración de proteínas por el método de Bradford, lo que proporcionará una medida indirecta de la actividad enzimática.


 

PROTOCOLO DE LAS EXPERIENCIAS

I. PROTEÍNAS

1. Reacción del biuret

Reactivos y muestras:

·        Dispersiones de diferentes proteínas

·        Dispersión de una proteína conocida (control positivo)

·        Agua destilada o solución en la que está disuelta la proteína (Control negativo)

·        Hidróxido de sodio al 10%

·        Sulfato de cobre al 10%

Protocolo de la Reacción del Biuret

Colocar en un tubo de ensayo:

Solución a investigar

0,5 ml

Hidróxido de sodio al 10%

0,5 ml

Sulfato de cobre al 1%

1 gota

mezclar por agitación

 

Ensayo cualitativo de proteínas

·        Tomar 4 tubos de ensayo

·        Rotularlos como se indica en la segunda columna de la siguiente tabla

·        Empleando el protocolo correspondiente, realizar la reacción del biuret con cada una de las soluciones indicadas en la tercera columna de la misma tabla

Tipo de Ensayo

Rotular

Solución a investigar

Control Negativo (Blanco)

B

Agua destilada

Control Positivo

P

Caseína al 0,1%

Muestra 1

G

Gelatina comercial al 1%

Muestra 1

H

Clara de huevo al 10%

Interpretar los resultados.

2. Reacción de Bradford

Reactivos y muestras:

·        u Dispersiones de diferentes proteínas

·        Dispersión de una proteína conocida (control positivo)

·        Agua destilada o solución en la que está disuelta la proteína (Control negativo)

·        Reactivo de Bradford

Protocolo de la reacción de Bradford

Colocar en un tubo de ensayo:

Solución a investigar

0,05 ml

Reactivo de Bradford

2,50 ml

mezclar por agitación y dejar en reposo 5 min

Nota: la medida de la solución a investigar se realizará con pipeta automática o en su defecto con pipetas de 0,1 ml

2.1. Ensayo cualitativo de proteínas

·        Tomar 4 tubos de ensayo

·        Rotularlos como se indica en la segunda columna de la tabla

·        Empleando el protocolo correspondiente, realizar la reacción del biuret con cada una de las soluciones indicadas en la tercera columna

Número de ensayo

Rotular

Solución a investigar

Control Negativo (Blanco)

B

Agua destilada

Control Positivo

P

Caseína al 0,1%

Muestra 1

G

Gelatina comercial al 1%

Muestra 2

C

Clara de huevo al 10%

Interpretar los resultados.

2.2. Ensayo cuantitativo

2.2.1. Confección de la curva de calibración para el método de Bradford

Se utilizarán diferentes diluciones de albúmina bovina (proteína patrón) para lo cual se partirá de una solución que contiene 1mg/ml. Sobre dichas soluciones se lleva a cabo la reacción de Bradford como se indicó anteriormente. Deberá realizarse un ensayo en blanco. El rango de detección de proteínas por este método es de 0,1 a 1 mg/ml.

La curva de calibración se obtendrá graficando los datos de absorbancia correspondientes a cada una de las distintas soluciones leída a 595 nm (A595) en función de la concentración de la proteína patrón.

Preparación de las diluciones de albúmina

Rotular

Albúmina 1 mg/ml

Agua destilada

Agregar en cada tubo las sustancias indicadas en las columnas de la derecha y mezclar

B

----

1,0 ml

100

0,1 ml

0,9 ml

250

0,25 ml

0,75 ml

500

0,5 ml

0,5 ml

750

0,75 ml

0,25 ml

1000

1,0 ml

 ----

Determinación de la absorbancia para cada dilución de albúmina

·        Rotular un tubo para cada muestra y uno para el blanco

·        Realizar la reacción de Bradford como se indicó en el correspondiente protocolo

·        Determinación de la A595 a las diferentes diluciones de albúmina

Confección de la curva de calibración

En computadora o sobre papel milimetrado graficar A595 vs. concentración.

2.2.2. Extracción y cuantificación de las proteínas presentes en los frutos de ananá

1)    Obtener por prensado el jugo de una rodaja de ananá de 2 cm de espesor

2)    Medir el volumen obtenido

3)    Precipitar las proteínas contenidas en 2,5 ml de jugo por la adición de 7,5 ml de acetona fría. Atención: la acetona será agregada gota a gota y la mezcla jugo-acetona será mantenida en un baño de hielo para evitar la desnaturalización proteica.

4)    Centrifugar y eliminar el sobrenadante.

5)    Redisolver el precipitado obtenido en 2,5 ml de buffer fosfatos 0,1M de pH 7,5 y realizar la reacción de Bradford como indica el protocolo

6)    Determinar el contenido de proteínas por ml de jugo empleando la curva de calibración realizada anteriormente

3. Ensayos de estabilidad de proteínas en dispersión acuosa

3.1. Efecto del pH

·        En un tubo de ensayo colocar 1 ml de dispersión de caseína de leche al 1%

·        Agregar ácido acético al 10% gota a gota hasta obtener un precipitado

·        Al observar la formación de precipitado comenzar a agregar hidróxido de sodio al 10% hasta lograr la redisolución del precipitado

·        Interpretar los resultados obtenidos.

3.2. Efecto de agentes deshidratantes

·        En un tubo de centrífuga colocar 1 ml de dispersión de gelatina al 1%

·        Agregar gota a gota solución saturada de sulfato de amonio hasta que no se observe más formación de precipitado

·        Interpretar los resultados obtenidos.

3.3. Efecto de solventes orgánicos

·        En un tubo de ensayo colocar 1 ml de dispersión de caseína de leche al 1%

·        Agregar acetona fría gota a gota y agitando

·        Observar el fenómeno de precipitación

·        Interpretar los resultados obtenidos.

4. Electroforesis de proteínas séricas sobre tiras de cellogel

Equipamiento

         Cuba electroforética

        Fuente de poder

Reactivos:

        Buffer de corrida: Veronal - veronal sódico, pH 8,6.

        Colorante: Amidoschwarz 10B.

        Decolorante: ácido acético al 5%.

        Deshidratante: metanol puro.

        Transparentizante: metanol/ácido acético/glicerol.

Técnica:

1.    Sumergir en el buffer las tiras durante diez minutos y luego secarlas entre papeles de filtro

2.    Colocar el buffer en la cuba electroforética

3.    Extender las tiras sobre el puente de la cuba, con la superficie permeable hacia arriba

4.    Sembrar la muestra a un centímetro del borde

5.    Conectar la fuente de poder de tal modo que el polo negativo quede en el lado de la siembra y correr durante 75 minutos

6.    Desconectar la fuente de poder

7.    Secar las tiras y sumergirlas en la solución colorante durante cinco minutos

8.    Sumergir tres o cuatro veces en solución decolorante

9.    Sumergir las tiras en el deshidratante durante treinta minutos

10.           Pasarlas a la solución transparentizante durante un minuto

11.           Colocarlas sobre una placa de vidrio adhiriéndolas bien y dejar en estufa durante unos minutos

12.           Observar las bandas e interpretar los resultados.

 

 

 

II. ENZIMAS

1. Degradación de almidón por acción de LA amilasa salival

1.1. Preparación de la solución stock de enzima

Colocar gotas de saliva diluídas en 0,5 ml de agua destilada.

1.2. Ensayo cualitativo. Detección de la atividad amilásica

·        Agregar 0.5 ml de la solución stock de amilasa salival a un tubo “Lugol positivo” (solución de almidón más Lugol, color violáceo)

·        A otro tubo “Lugol positivo” agregar 0,5ml de agua destilada

·        Luego de unos minutos, el tubo con saliva comenzará a cambiar de color por desaparición del complejo almidón-yodo

·        Anotar el cambio de color e interpretar los resultados.

2. Determinación de LA actividad proteolítica en jugo de ananá

       

2.1. Preparación del stock de enzima.

·        Se utilizará el extracto proteico (precipitado acetónico redisuelto) del jugo de ananá obtenido anteriormente.

2.2. Medida de la actividad proteolítica

Protocolo para la determinación de la actividad proteolítica

·        Colocar los tubos para los ensayos y el blanco, debidamente rotulados, en un baño a 37 oC

·        Agregar los reactivos indicados en la tabla, en el orden indicado

Reactivo

Ensayo

Blanco

Muestra

0,1ml

0,1ml

TCA al 5%

– – –

2 ml

Caseína al 1%

1 ml

1 ml

Incubar a 37 oC durante el tiempo indicado

TCA al 5%

2 ml

– – –

·        Centrifugar los tubos a 3.000 rpm durante 10’

·        Tomar 1,5 ml del sobrenadante y alcalinazarlo por agregado de 0,5 ml de OHNa 1M

·        Agregar una gota de SO4Cu

·        Comparar los resultados

2.2.1. Efecto del pH

Según el protocolo indicado arriba se determinará la actividad enzimática empleando como sustrato soluciones de caseína al 1% disuelta en soluciones de diferente valor de pH (2; 7 y 11)

·        Rotular cuatro tubos de la siguiente manera: “B” (para el blanco), “2” (para la solución de caseína de pH 2), “7” (para la solución de caseína de pH 7) y “11” (para la solución de caseína de pH 11)

·        Agregar los reactivos según se indica en la tabla del protocolo

·        Cortar la reacción enzimática a los cinco minutos por agregado de TCA 5%

·        Continuar el desarrollo del protocolo

·        Interpretar los resultados obtenidos

2.2.2. Efecto del tiempo

Según el protocolo indicado arriba se determinará la actividad enzimática empleando como sustrato solución de caseína al 1% a pH 7, cortando la reacción a diferentes tiempos (2, 5 y 10 minutos).

·        Rotular cuatro tubos: de la siguiente manera: “B” (para el blanco),y  “2”, “5” y “10” para los ensayos a los diferentes tiempos

·        Agregar los reactivos según se indica en la tabla

·        Cortar la reacción enzimática del tubo 2 a los dos minutos

·        Cortar la reacción enzimática del tubo 5 a los cinco minutos

·        Cortar la reacción enzimática del tubo 10 a los diez minutos

·        Continuar el protocolo

IMPORTANTE: Es imprescindible que todo el material de vidrio utilizado se encuentre perfectamente limpio. El lavado se realiza con detergente. Debe enjuagarse repetidas veces con agua de la canilla para que  no queden restos de detergente (interfiere en el método de Bradford). Finalmente enjuague con agua destilada.

 

CUESTIONARIO DEL TRABAJO EXPERIMENTAL

1)    En tres dispersiones acuosas A, B y C, de composición desconocida, se realizaron diversos ensayos con los siguientes resultados:

Reacción

Muestra A

Muestra B

Muestra C

Biuret

+

-

-

Lugol

-

-

+

Fehling

+

+

-

Precipitación con (NH4)2SO4

+

-

-

En base a los resultados del cuadro, qué compuesto/s podrán hallarse en cada una de las muestras?

2) Qué reacciones de caracterización realizaría para verificar la naturaleza proteica de la gelatina? Cuál es el fundamento de esta reacción de caracterización? Indicar reactivos y visualización de la reacción.

3) Una proteína con estructura helicoidal, da positiva la reacción de Lugol?.

4) Si realiza la reacción del biuret sobre una solución del aminoácido alanina, obtendrá resultado (+) ó (-)?

5) ¿Puedo utilizar el método de biuret para identificar albúmina bovina en una mezcla de proteínas? Fundamente su respuesta.

6) ¿En qué caso el resultado de la reacción de biuret puede generar un falso negativo?

7) Se realiza la reacción de Bradford  en una muestra problema y los resultados son los siguientes:

agua destilada: (-)

muestra: (-)

solución de caseína al 1%: (+)

Explique los resultados obtenidos

8) ¿Qué operaciones debería efectuar si se desea cuantificar el contenido de proteínas en el jugo de ananá?

9) Explique el efecto del (NH4)2SO4 sobre las proteínas.

10) ¿Cuál es el fundamento de la técnica de electroforesis?. ¿De qué factores depende la migración diferencial de las moléculas? ¿A qué tipo de compuestos puede aplicarse esta metodología?

11) Diseñe las condiciones de una experiencia electroforética que le permita separar tres proteínas (A, B y C), cuyos pesos moleculares son del mismo orden pero cuyos puntos isoeléctricos tienen los siguientes valores: 8.3, 5.1 y 7.2, respectivamente. Fundamente su respuesta.

12) En qué dirección migrarán las siguientes proteínas puestas en un campo eléctrico al pH indicado ?

        a) Seroalbúmina  a pH = 5   (p I=4,9; PM = 68.500)

        b- Quimotripsinógeno a pH = 5,  pH= 9  y pH=11   (pI=9,5  PM=23.240)

13) ¿Cuál es la razón para utilizar un reactivo de caracterización de hidratos de carbono (Lugol) en la determinación de la actividad de la amilasa salival, que es una proteína?

14) ¿Por qué en los ensayos en blanco de actividad proteolítica agrega ácido tricloroacético antes de agregar el sustrato?

15) En la determinación de la actividad proteolítica del jugo de ananá usted determinó la existencia de péptidos que han sido producidos por la hidrólisis enzimática de la caseina a través de la reacción del biuret. ¿Es esta una medida directa o indirecta de la actividad? ¿De qué otro modo podría realizarla?

16) ¿Qué información aporta el conocer el valor de la actividad enzimática a diferentes valores de pH?

17) ¿Cuál es el objeto de realizar la medida de la actividad enzimática a diferentes tiempos?


 


[1] EC son las iniciales del Comité de Enzimas (Enzyme Committee) de la Unión Internacional de Bioquímca y Biología Molecular.

[2] En la mayoría de las reacciones de coloración la intensidad del color producido es proporcional a la concentración del compuesto en la muestra. Esta intensidad puede ser evaluada  espectrofotométricamente por medida de un parámetro específico: la absorbancia.